A LIBERDADE... A VONTADE... “UMA PROTEÍNA ABALA o REINO UNIDO” – 2º “capítulo”.




O QUE SÃO PROTEÍNAS?  – 3ª parte do 2º “capítulo”.



PURIFICAÇÃO de PROTEÍNAS.



Ver artigo principal: Purificação de PROTEÍNAS.


     Antes de se poder efetuar uma análise in vitro, a PROTEÍNA deve ser purificada dos restantes componentes CELULARES.
     Este processo de purificação geralmente tem início com a citólise da CÉLULA, através da qual a membrana CELULAR é rompida e o conteúdo interno libertado para uma solução denominada lisado bruto.
    

     Observação do escriba: - “Lisado de TIMUS de VITELA” os leitores já ouviram falar. Dr. Luiz Moura falou e eu já transcrevi em um artigo anterior.


     A mistura daí resultante pode ser purificada através de ultracentrifugação, a qual fraciona os vários componentes CELULARES em frações que contêm PROTEÍNAS solúveis, PROTEÍNAS e lipídios membranares, organelas CELULARES e ácidos nucleicos.
     As PROTEÍNAS deste lisado são então concentradas através de precipitação, feita através do método de relargagem.
     São depois usados vários tipos de cromatografia para isolar a PROTEÍNA ou as PROTEÍNAS pretendidas, de acordo com propriedades como o peso molecular ou afinidade de ligação.
     O nível de purificação pode ser monitorizado através de vários tipos de eletroforese em gel, quando são conhecidos o peso molecular e o ponto isoelétrico, através de espectroscopia, quando a PROTEÍNA possui características espectroscópicas distintas, ou através de análise enzimática, quando a enzima tem atividade enzimática.
    As PROTEÍNAS podem ainda ser isoladas de acordo com a sua carga através de focalização isoelétrica.
     No caso das PROTEÍNAS NATURAIS, podem ser necessárias mais etapas no processo de purificação de forma a obter PROTEÍNAS suficientemente puras para serem usadas em laboratório.
     Para simplificar este processo, recorre-se muitas vezes a ENGENHARIA GENÉTICA para acrescentar às PROTEÍNAS características químicas que as tornem mais fáceis de serem purificadas sem, no entanto, afetar a sua estrutura ou atividade.
     Neste caso, a um dos terminais da PROTEÍNA é acrescentada uma etiqueta constituída por uma sequência de AMINOÁCIDOS específica, geralmente uma série de resíduos de histidina (etiqueta de poli-histidina).
     Desta forma, quando o lisado é passado sobre uma coluna de cromatografia contendo níquel, os resíduos de histidina ligam-se com o níquel e agarram-se à coluna, enquanto os componentes do lisado sem a etiqueta passam sem entraves.
     Têm vindo a ser desenvolvidas diversas etiquetas de modo a auxiliar os investigadores na purificação de PROTEÍNAS a partir de misturas complexas.



LOCALIZAÇÃO CELULAR.



     “Foto: PROTEÍNAS em diferentes compartimentos e estruturas etiquetadas com PROTEÍNA verde fluorescente”.


    
     O estudo de PROTEÍNAS in vivo dedica-se às questões relacionadas com a síntese e localização de PROTEÍNAS no interior de CÉLULAS.
     Embora muitas das PROTEÍNAS intracelulares sejam sintetizadas no citoplasma e as PROTEÍNAS segregadas sejam sintetizadas no retículo endoplasmático, o processo específico de como as PROTEÍNAS se orientam para organelas ou estruturas CELULARES específicas é em muitas situações pouco claro.
     Uma das técnicas para avaliar a localização CELULAR recorre à ENGENHARIA GENÉTICA para expressar numa CÉLULA uma PROTEÍNA de fusão, a qual é constituída pela PROTEÍNA em estudo ligada a um gene repórter, como por exemplo a PROTEÍNA verde fluorescente.
     A posição da PROTEÍNA de fusão na CÉLULA pode então ser facilmente visualizada através de MICROSCOPIA.
     Outros métodos para obtenção da localização CELULAR de PROTEÍNAS requerem o uso de marcadores compartimentais conhecidos para diversas regiões CELULARES.
     Com o uso de versões destes marcadores etiquetadas com fluorescência, torna-se mais simples a identificação e localização da PROTEÍNA pretendida.
     A técnica padrão para localização CELULAR é a MICROSCOPIA IMUNOELETRÔNICA.
     Esta técnica usa um anticorpo para a PROTEÍNA pretendida, a par de técnicas clássicas de MICROSCOPIA ELETRÔNICA.
     A amostra é preparada para uma análise MICROSCÓPICA padrão, sendo depois tratada com um anticorpo dessa PROTEÍNA que é conjugado com um material eletro-denso, geralmente OURO.  
     Através de mutagênese sítio-dirigida, os investigadores podem alterar a sequência PROTEICA, alterando dessa forma a sua estrutura, localização CELULAR e suscetibilidade à regulação.
     Esta técnica permite ainda a incorporação nas PROTEÍNAS de AMINOÁCIDOS não naturais, usando RNAt modificado, podendo ainda permitir a conceção de novas PROTEÍNAS com novas propriedades.



PROTEÔMICA e BIOINFORMÁTICA.



     Ver artigos principais: Proteômica e bioinformática.


     O conjunto total de PROTEÍNAS presentes numa CÉLULA em determinado momento é denominado PROTEOMA, e o estudo em grande escala destes conjuntos define o campo da PROTEÔMICA, assim denominado em analogia ao campo relacionado da GENÔMICA.
     Entre as principais técnicas da PROTEÔMICA estão a eletroforese bidimensional, a qual permite a separação de um vasto número de PROTEÍNAS, a espectrometria de massa, a qual permite a rápida identificação de PROTEÍNAS e sequenciação de peptídeos, o micro arranjo de PROTEÍNAS, que permite a detecção dos níveis relativos do grande número de PROTEÍNAS presentes na CÉLULA, e o sistema de duplo híbrido, que permite a exploração sistemática de interações PROTEÍNA-PROTEÍNA.
     O conjunto total e biologicamente possível destas interações é denominado INTERACTOMA.
     O esforço sistemático para determinar as estruturas de PROTEÍNAS e de todos os enovelamentos possíveis é denominado GENÔMICA ESTRUTURAL.



PREVISÃO e SIMULAÇÃO da ESTRUTURA.



     “Foto: Os AMINOÁCIDOS que constituem a PROTEÍNA podem ser analisados de modo a prever as estruturas PROTEICAS secundária, terciária e quaternária, neste caso da HEMOGLOBINA”.


     Complementar ao campo da GENÔMICA ESTRUTURAL, a previsão de estruturas das PROTEÍNAS procura desenvolver métodos eficientes de fornecer modelos plausíveis para PROTEÍNAS cujas estruturas não foram ainda determinadas experimentalmente.
     O mais bem-sucedido método de previsão estrutural, denominado MODELAÇÃO por HOMOLOGIA, assenta na existência de uma estrutura-modelo com uma sequência semelhante à PROTEÍNA a ser modelada.
     O objetivo da GENÔMICA ESTRUTURAL é fornecer uma representatividade suficiente de estruturas resolvidas que sirva de modelo a todas as restantes.
     Os processos de enovelamento e ligação PROTEICA podem ser simulados usando técnicas como a DINÂMICA MOLECULAR ou o método de Monte Carlo, os quais têm vindo cada vez mais a tirar partido da computação distribuída, como o projeto Folding@home.
     O enovelamento de pequenos domínios PROTEICOS de alfa-hélice, como a PROTEÍNA acessória do VIH, tem vindo a ser simulado com sucesso in silico.
     Os métodos híbridos que combinam DINÂMICA MOLECULAR com cálculo de MECÂNICA QUÂNTICA têm permitido a exploração dos estados eletrônicos das RODOPSINAS.



HISTÓRIA e ETIMOLOGIA.




     As PROTEÍNAS foram pela primeira vez descritas pelo QUÍMICO HOLANDÊS Gerardus Johannes Mulder e assim batizadas pelo QUÍMICO SUECO Jöns Jacob Berzelius em 1838.
     Mulder levou a cabo análises elementares de PROTEÍNAS vulgares e constatou que praticamente todas as PROTEÍNAS apresentavam a mesma FÓRMULA EMPÍRICA – C400H620N100O120P1S1.
     Ainda que erradamente, concluiu que as PROTEÍNAS deveriam ser constituídas por um único tipo de molécula de grande dimensão.
     O termo "PROTEÍNA" para descrever estas moléculas foi proposto pelo sócio de Mulder, Berzelius.
     PROTEÍNA deriva da palavra grega πρωτεῖος (PROTEIOS), a qual significa "na liderança" ou "a que está à frente".
     Mulder prossegue a investigação, identificando produtos da degradação PROTEICA, como o AMINOÁCIDO  LEUCINA, para o qual determinou o peso molecular quase preciso de 131 Da.
     Os CIENTISTAS pioneiros no campo da NUTRIÇÃO, como o ALEMÃO Carl von Voit, acreditavam que a PROTEÍNA era o mais importante NUTRIENTE na manutenção da estrutura corporal, uma vez que existia a crença generalizada de que seria a CARNE tinha origem na própria CARNE.
     Karl Heinrich Ritthausen alargou o campo das PROTEÍNAS conhecidas com a identificação do ÁCIDO GLUTÂMICO.
     Thomas Burr Osborne compilou em 1909 uma revisão detalhada de todas as PROTEÍNAS VEGETAIS e, no mesmo ano e em conjunto com Lafayette Mendel, determinou os AMINOÁCIDOS ESSENCIAIS à sobrevivência de ratos de laboratório aplicando a lei de Liebig.
     A compreensão das PROTEÍNAS enquanto polipeptídeos foi proporcionada por Franz Hofmeister e Hermann Emil Fischer.
     O papel central das PROTEÍNAS enquanto enzimas nos organismos vivos foi determinado em 1926, quando James Batcheller Sumner demonstrou que a UREASE era de fato uma PROTEÍNA.


     “Foto: John Kendrew com um modelo de MIOGLOBINA”.


     A dificuldade em purificar PROTEÍNAS em grande quantidade dificultou imensamente a investigação dos primeiros BIOQUÍMICOS.
     Assim, a investigação inicial focou-se sobretudo em PROTEÍNAS que podiam ser facilmente purificadas em quantidade, como as do SANGUE, da CLARA de OVO, diversas toxinas e enzimas digestivas obtidas em matadouros.
     Atribui-se a Linus Pauling a primeira previsão bem-sucedida de estruturas secundárias de PROTEÍNAS com base nas ligações de hidrogênio, uma ideia que já tinha sido proposta em 1933 por William Astbury.
     Posteriormente, a investigação de Walter Kauzmann sobre a desnaturação, baseada em parte nos estudos anteriores de Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang, veio a contribuir para a compreensão do enovelamento de PROTEÍNAS e das estruturas mediadas por interações hidrófugas.
     A PRIMEIRA PROTEÍNA a ser SEQUENCIADA foi a Insulina, por Frederick Sanger em 1949.
     Sanger determinou corretamente a SEQUÊNCIA de AMINOÁCIDOS da PROTEÍNA, demonstrando de forma conclusiva que as PROTEÍNAS eram constituídas por POLÍMEROS LINEARES de AMINOÁCIDOS, em vez de cadeias ramificadas ou coloides.
     As primeiras estruturas PROTEICAS a serem resolvidas foram as da HEMOGLOBINA e da MIOGLOBINA, por Max Perutz e John Kendrew, respectivamente, em 1958.
     Nas décadas posteriores, a CRIO-MICROSCOPIA ELETRÔNICA de grandes conjuntos MACROMOLECULARES e a previsão COMPUTACIONAL de estruturas PROTEICAS de pequenos domínios foram métodos que permitiram a investigação de PROTEÍNAS à ESCALA ATÔMICA.
     No início de 2014, estavam registadas no Protein Data Bank aproximadamente 90.000 estruturas PROTEICAS com RESOLUÇÃO ATÔMICA.



Observações do escriba


     1ª - Na Wikipédia estão disponíveis 100 (cem) Referências e a impressionante quantidade de 99 (noventa e nove) Bibliografias sobre as PROTEÍNAS.

     2ª – A história das PROTEÍNAS nos remete ao ano de 1838 (século XIX) com o pioneirismo de dois QUÍMICOS.

     3ª – O chamado Projeto GENOMA e a Engenharia Genética estão envolvidos até o pescoço nos estudos das PROTEÍNAS.  

     4ª – Tais estudos nos deveriam trazer grandes e boas novidades. Surgiu uma novidade. Só que a novidade não foi muito boa. É o que veremos no 3º “capítulo”.  

     A luta contra a debilitante POLIOMIELITE (paralisia infantil) continua, e a luta a favor da inofensiva AUTO-HEMOTERAPIA (AHT), também continua.
      Se DEUS nos permitir voltaremos outro dia ou a qualquer momento. Boa leitura, boa saúde, pensamentos positivos e BOM DIA.
     ARACAJU, capital do Estado de SERGIPE (Ex-PAÍS do FORRÓ e futuro “PAÍS da BOMBA ATÔMICA”), localizado no BRASIL, Ex-PAÍS dos fumantes de CIGARROS e futuro “PAÍS dos MACONHEIROS”. Sábado, 02 de setembro de 2017.

Jorge Martins Cardoso – Médico – CREMESE – 573.



      Fontes: (1) – Wikipédia. (2) – OUTRAS FONTES.